熒光定量PCR（qPCR）是一種通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)核酸定量分析的分子生物學(xué)技術(shù)。其核心原理、熒光標(biāo)記體系及Ct值解讀，構(gòu)成了該技術(shù)的三大支柱。
qPCR在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上引入熒光標(biāo)記系統(tǒng)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)跟蹤。當(dāng)熒光信號(hào)達(dá)到預(yù)設(shè)閾值時(shí)，所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值（CycleThreshold）。由于Ct值與起始模板量呈負(fù)相關(guān)（模板量越多，Ct值越?。Y(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量或相對(duì)定量分析。例如，在疾病診斷中，通過(guò)檢測(cè)病原體核酸的Ct值，可判斷感染程度；在基因表達(dá)研究中，比較不同樣本的Ct值差異，可分析基因表達(dá)水平。
二、熒光標(biāo)記體系：染料法與探針?lè)?/div>
染料法（SYBRGreenI）
SYBRGreenI是一種嵌入型熒光染料，可非特異性結(jié)合雙鏈DNA（dsDNA）。在游離狀態(tài)下，染料熒光微弱；與dsDNA結(jié)合后，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)1000倍。該方法操作簡(jiǎn)便、成本低，但無(wú)法區(qū)分特異性產(chǎn)物與非特異性擴(kuò)增（如引物二聚體），需通過(guò)熔解曲線分析驗(yàn)證產(chǎn)物特異性。
探針?lè)ǎ═aqMan探針）
TaqMan探針為寡核苷酸鏈，5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)熒光被淬滅；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’→3’外切酶活性切割探針，釋放報(bào)告基團(tuán)，熒光信號(hào)與產(chǎn)物量同步累積。該方法特異性強(qiáng)（需引物與探針雙重匹配）、靈敏度高（可檢測(cè)單拷貝基因），且支持多重檢測(cè)（通過(guò)不同熒光標(biāo)記區(qū)分多個(gè)靶基因）。
三、Ct值：定量分析的核心參數(shù)
Ct值是qPCR結(jié)果解讀的關(guān)鍵指標(biāo)，其大小直接反映起始模板量。例如，在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中，若患者樣本中某基因的Ct值顯著低于健康人群，可能提示基因過(guò)表達(dá)，與腫瘤發(fā)生相關(guān)。此外，Ct值還可用于評(píng)估實(shí)驗(yàn)效率：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率接近-3.32時(shí)，擴(kuò)增效率達(dá)100%；若斜率偏離，需優(yōu)化反應(yīng)條件（如引物濃度、退火溫度）。
四、應(yīng)用場(chǎng)景與優(yōu)勢(shì)
qPCR廣泛應(yīng)用于疾病診斷（如新冠病毒檢測(cè)）、基因表達(dá)分析、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)及SNP分型等領(lǐng)域。其核心優(yōu)勢(shì)包括：
高靈敏度：可檢測(cè)單拷貝基因；
高特異性：探針?lè)ㄍㄟ^(guò)雙重匹配確保結(jié)果準(zhǔn)確；
實(shí)時(shí)定量：無(wú)需電泳等后處理步驟，避免交叉污染；
寬動(dòng)態(tài)范圍：可覆蓋5-6個(gè)數(shù)量級(jí)的模板濃度。
從原理到應(yīng)用，qPCR以熒光信號(hào)為“量尺”，為生命科學(xué)研究與臨床診斷提供了精準(zhǔn)、高效的核酸定量工具。
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