2×RAPA3G Multiplex PCR Mix試劑

Multiplex PCR 又稱多重 PCR，是指在同一 PCR 反

應(yīng)體系里加上兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的

PCR 反應(yīng)，已被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和疾病診斷等多個領(lǐng)

域，特別適用于微量樣本的多位點檢測。

本制品使用具有擴增性能的熱啟動 RAPA3G DNA

聚合酶和優(yōu)化的多重 PCR 反應(yīng)緩沖液，使其可有效擴增 20

重以上的 PCR，具有的靈敏度，程度上減少了反應(yīng)

體系優(yōu)化步驟。

特性

? RAPA3G DNA 聚合酶，擴增性能強，抗雜質(zhì)能力

? 封閉的熱啟動特性，50℃以下 100%無活性

? 優(yōu)化的反應(yīng)緩沖體系，避免非特異性擴增

? 高靈敏度，有效擴增 0.1ng 的人基因組 DNA（20 重）

包裝

A0610A 1 ml 

A0610B 1 ml ×10

儲存：長期儲存置于-20°C 以下，可保存 2 年；短期使用置

于 4°C（3 個月）保存。

使用方法

1. 按下表配制反應(yīng)體系并混合均勻：

2×RAPA3G Multiplex PCR Mix 12.5 μl

10×Primer Mix 2.5 μl

*模板 DNA 0.1~100 ng

ddH2O up to 25 μl

*模板 DNA：人的基因組 100 ng，質(zhì)粒 100 pg，cDNA 1-5 μl。

2. PCR 擴增循環(huán)參數(shù)

循環(huán)數(shù) 溫度 時間

預(yù)變性 95°C 5min

30-35Cycles

95°C 20s

57~60℃ 60s

72°C 2kb/min

末延伸 72°C 10min

請注意：該制品為熱啟動制品預(yù)變性步驟 5min 不可縮短，

否則 DNA 聚合酶無法恢復(fù)活性。

3. 電泳：1kb 以內(nèi)的擴增產(chǎn)物建議使用 3%~4% 瓊脂糖凝

膠，電壓使用 80V，可以有效的分離各擴增片段。

4. 注意事項：

（1）當(dāng)模板 GC 含量>70%時，請?zhí)砑?5×Q-Solution（Cat. 

No.: A3002）。

（2）推薦引物設(shè)計原則：引物長度保持在 22 - 30 bp，擴增

產(chǎn)物長度在 2kb 以下，GC 含量 50% - 60%，盡量減少各引

物之間 TM 的差值。

（3）檢測單引物特異性：多重 PCR 反應(yīng)前，應(yīng)對設(shè)計的引

物逐一擴增，以確定是否有非特異性擴增和擴增效率。

（4）引物推薦使用濃度：推薦擴增片段<300bp 每條引物的

反應(yīng)終濃度為 0.2-0.3μM，擴增片段>300bp 每條引物的反

應(yīng)終濃度為 0.05-0.15μM，如某些目標(biāo)片段產(chǎn)量偏低或偏高，

可適度調(diào)整其對應(yīng)引物使用量以優(yōu)化反應(yīng)結(jié)果。

（5）反應(yīng)前需將引物制成 10×Primer Mix：

引物儲存液 用量 10x 濃度

引物 1 F（100μM） 1 μl 1 μM

引物 1 R（100μM） 1 μl 1 μM

引物 2 F（100μM） 0.5 μl 0.5 μM

引物 2 R（100μM） 0.5 μl 0.5 μM

………….

引物 n F（100μM） 3 μl 3 μM

引物 n R（100μM） 3 μl 3 μM

ddH2O Upto 100μl

常見問題及解答：

1. 擴增產(chǎn)物少或沒有擴增。

(1) 降低退火溫度（每個梯度降低 1℃）。

(2) 增加模板量

(3) 增加 PCR 循環(huán)數(shù)。

(4) 增加退火時間為 90 sec，必要時可延長退火時間至 3 

min。

(5) 增加引物使用量。

2. 存在非特異性擴增。

(1) 減少循環(huán)數(shù)，提高退火溫度（每個梯度降低 1℃）。

(2) 減少引物使用量。

(3) 重新設(shè)計引物。

3. 電泳時條帶模糊。

(1) 減少循環(huán)數(shù)(每次減少 3 個循環(huán))。

(2) 減少起始模板量。

(3) 延長延伸步驟時間至 15 - 30 min。

(4) 減少退火時間。

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